Comenzó a funcionar el 7 de agosto de 1779 cuando el virrey Juan José de Vértiz y Salcedo, como parte del Virreinato del Río de la Plata fundó el "Hospital y Casa de Niños Expósitos", en Buenos Aires, en las actuales calles Perú y Alsina, en un edificio que había pertenecido a la orden de los jesuitas. Funcionó durante toda la época de la formación de la Nación y, en 1873, se trasladó a un edificio circular en la Loma de Santa Lucía, actual Avenida Montes de Oca de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires.
La Casa Cuna fue dirigida entre 1935 y 1946 por el Dr. Pedro de Elizalde, quien creó la Revista Infancia, la Cátedra de Pediatría e introdujo el método de identificación de los niños recién nacidos, que es el que permanece en uso hasta el presente. Durante la gestión de Ramón Carrillo como ministro nacional se incorporó la mayoría del mobiliario actual y se anexaron nuevos pabellones, pasando en capacidad de 50 camas a más de 200. Asimismo, la primera dama Eva Perón donó en 1953 el mobiliario para inaugurar la unidad de cuidados intensivos. En 1961 se le impuso el actual nombre de Hospital "Pedro de Elizalde", aunque es conocido también por su tradicional denominación de "Casa Cuna".